AntiRetroScan
(ultimo aggiornamento 10 febbraio 2007)
Principio del metodo
Il sistema interpretativo AntiRetroScan è stato sviluppato presso il Servizio di Monitoraggio HIV dell’Università di Siena (SHMS) nell’aprile 2001. Concepito inizialmente come ‘utility’ per eseguire off-line e memorizzare l’interpretazione del genotipo secondo l’algoritmo utilizzato presso l’Università di Stanford , AntiRetroScan è stato in seguito aggiornato indipendentemente dal sistema da cui deriva.
Come l’algoritmo dell’Università di Stanford, AntiRetroScan analizza la sequenza in esame estraendo le mutazioni che, secondo le proprie liste di riferimento, sono implicate nei fenomeni di farmacoresistenza. Ad ogni mutazione di resistenza corrisponde un valore numerico per ogni farmaco, attribuito sulla base della variazione di suscettibilità prevista. La somma dei valori delle mutazioni individuate nella sequenza in esame genera un totale per ciascun farmaco, consentendo di stimare il livello di resistenza in base a cinque intervalli numerici definiti.
A differenza del sistema dell’Università di Stanford, AntiRetroScan include anche una serie di rimodellamenti che alterano il punteggio totale per farmaco in presenza di condizioni definite (regole). Questo approccio è utilizzato con l’intento di considerare opportunamente gli effetti sinergistici delle interazioni fra mutazioni non gestibili con la semplice addizione dei singoli valori per ogni mutazione. In tal senso AntiRetroScan è quindi un sistema ibrido, diverso dagli algoritmi basati unicamente su punteggi (Stanford) oppure su regole (es. Bayer Trugene, ANRS, Retrogram).
Output di AntiRetroScan
L’interpretazione del genotipo è espressa in termini di resistenza prevista e si articola su cinque livelli:
1.	NULLA
	Assenza di mutazioni di resistenza primarie
	Piena sensibilità al farmaco
2.	TRASCURABILE
	Mutazioni secondarie o mutazioni di resistenza per altri farmaci in grado di conferire una minima cross-resistenza
	Risposta al farmaco altamente probabile
3.	PARZIALE
	Quadro iniziale di resistenza o mutazioni di resistenza per altri farmaci in grado di conferire una parziale cross-resistenza
	Risposta al farmaco ancora possibile ma ulteriore evoluzione di resistenza probabile
4.	CONSISTENTE
	Quadro avanzato di resistenza o mutazioni di resistenza per altri farmaci in grado di conferire cross-resistenza significativa
	Risposta al farmaco irrilevante o di entità molto limitata
5.	ELEVATA
	Quadro di resistenza o cross-resistenza completa
	Risposta al farmaco compromessa
Fonti per la definizione dei punteggi e delle regole
I punteggi attribuiti ad ogni coppia mutazione-farmaco e le regole di rimodellamento sono definite e periodicamente aggiornate sulla base delle seguenti evidenze:
Correlazione genotipo-suscettibilità in vitro. Dati derivati dagli studi in vitro condotti su varianti selezionate in laboratorio o isolate da pazienti sotto trattamento terapeutico. Questo tipo di informazione è di solito la prima ad essere resa disponibile, già in fase di sviluppo del farmaco. Fornisce indicazioni di partenza essenziali per la comprensione del profilo di resistenza. Tuttavia i sistemi per la misurazione della suscettibilità in vitro non sono esenti da limiti. Ad esempio può risultare difficile evidenziare certi tipi di resistenza oppure le condizioni sperimentali impiegate possono privilegiare alcuni mutanti che di fatto risulteranno poi estremamente rari in vivo.
Correlazione genotipo-risposta virologica in vivo . Queste informazioni, ottenute nell’ambito di trial o anche di studi osservazionali, rappresentano la fonte più affidabile per disegnare le regole interpretative, essendo direttamente correlate all’obiettivo della genotipizzazione. La complicazione deriva dalla difficoltà di estrapolare indicazioni farmaco-specifiche in presenza di regimi terapeutici di combinazione. Sono molto utili in tale contesto i piccoli studi pilota in monoterapia e le valutazioni di tipo ‘add-on’, nelle quali un singolo farmaco è aggiunto al regime terapeutico pre-esistente.
Correlazione genotipo-storia terapeutica . Questo tipo di correlazione può essere adeguatamente studiato solo disponendo di ampie casistiche registrate in banche dati. L’associazione fra trattamento e variazioni del genoma virale può essere studiata sia trasversalmente sia longitudinalmente, qualora siano disponibili dati successivi ottenuti su uno stesso paziente. L’analisi può rivelarsi utile per una migliore definizione del ruolo di mutazioni non ancora ben caratterizzate ma coinvolte nei meccanismi di resistenza. La complessità del trattamento, specialmente in pazienti multitrattati, complica però questo tipo di valutazione poiché molte mutazioni possono essere state selezionate da un farmaco non più facente parte del regime terapeutico ma mantenute da altri farmaci in uso.
Prestazioni
AntiRetroScan (versione 1.4 del 12/10/2002) è stato valutato assieme al sistema on-line dell’Università di Stanford (HIVdb , versione aggiornata in agosto 2002) e al sistema offerto come parte integrante del kit commerciale Trugene HIV-1 Genotyping Test (Visible Genetics/Bayer, rules 6.0, febbraio 2002). I tre sistemi sono stati impiegati per l’analisi di una serie di oltre 1300 sequenze per un totale di oltre 9000 interpretazioni di suscettibilità in vitro note (fenotipo reale secondo AntivirogramTM o PhenosenseTM) o previste (VirtualPhenotypeTM). AntiRetroScan, Trugene e HIVdb hanno generato una percentuale di discordanze (sensibile/resistente o viceversa) del 8.0%, 10.9% e 12.7% rispetto al fenotipo reale e del 2.7%, 5.6% e 6.6% rispetto al fenotipo virtuale.
AntiRetroScan non è stato ancora valutato come sistema per la predizione della risposta virologica al trattamento.
Per ulteriori dettagli possono essere consultati i seguenti documenti:
Zazzi M, Romano L, Venturi G, Valensin PE. Use of an in-house Windows-based desktop program for prediction of drug susceptibility from HIV genotype. First European HIV Drug Resistance Workshop. Luxembourg, March 6-8, 2003. (poster in formato pdf)
Zazzi M, Romano L, Venturi G, Shafer RW, Reid C, Dal Bello F, Parolin C, Palù G, Valensin PE. Comparative evaluation of three computerized algorithms for prediction of antiretroviral susceptibility from human immunodeficiency virus type 1 genotype. J Antimicrob Chemother 2004;53:356-60. (MEDLINE)
Cronologia revisioni
-	02/04/2001. Versione 1.0. Inizio utilizzazione di AntiRetroScan come strumento indipendente dallo HIVdb di Stanford.
-	01/06/2001. Versione 1.1. Inserimento di nuova regola per la sinergia fra M184V e TAMs nel conferimento di resistenza ad abacavir.
-	23/07/2001. Versione 1.2. Aggiornamento del punteggio di molte mutazioni per tutti gli inibitori di trascrittasi, amprenavir e lopinavir/ritonavir.
-	29/01/2002. Versione 1.3. Aggiornamento del punteggio di alcune mutazioni (69D, 118I, 219R) per alcuni inibitori di trascrittasi (abacavir, didanosina, zalcitabina). Introduzione del tenofovir. Cambiamento nelle regole di rimodellamento dello score per lopinavir/ritonavir.
-	12/10/2002. Versione 1.4. Aggiornamento del punteggio di molte mutazioni per tutti gli inibitori di trascrittasi e di proteasi (soprattutto stavudina, tenofovir, lopinavir/ritonavir). Cambiamento in varie regole di rimodellamento dello score per diversi farmaci.
-	02/11/2003. Versione 1.5. Aggiornamento del punteggio di diverse mutazioni per vari inibitori di trascrittasi e di proteasi (soprattutto tenofovir, lopinavir/ritonavir). Introduzione di atazanavir. Introduzione di nuove note di commento per gli effetti sensibilizzanti di K65R (zidovudina), L74V/I (zidovudina, tenofovir), Y181C/I (zidovudina, tenofovir), M184V/I (zidovudina, stavudina, tenofovir).
-	05/10/2004. Versione 1.5.1. Aggiornamento della modalità di computo nel caso in cui sia presente una inserzione al codone 69 in RT contemporanea ad una sostituzione significativa allo stesso codone 69.
-	02/01/2006. Versione 1.6. Introduzione del tipranavir. Introduzione di alcune nuove mutazioni di resistenza individuate dall'analisi di correlazione genotipo-trattamento in più banche dati indipendenti e/o facenti parte di "mutation scores" riconosciuti dalla IAS (es. per ATV o TPV). Riconoscimento di un maggiore ruolo del pattern TAM #1 nella resistenza crociata agli NRTI. Rimodellamenti minori per tutti i farmaci.
-	10/02/2007. Versione 1.7. Introduzione del darunavir. Modifiche all'algoritmo del tipranavir. Rimodellamenti minori per alcune mutazioni.
Requisiti e limiti del sistema
AntiRetroScan accetta una sequenza di proteasi e/o trascrittasi inversa di HIV-1 purchè la proteasi comprenda almeno la regione aminoacidica 10-93 e la trascrittasi comprenda almeno la regione aminoacidica 41-219. In mancanza di tale requisito, il sistema avvisa che non può procedere nell’analisi. Proteasi e trascrittasi possono tuttavia essere esaminate separatamente nel caso si disponga di sequenze parziali. La sequenza di riferimento sulla base della quale AntiRetroScan compone la lista delle mutazioni individuate nella sequenza in esame è il consensus del sottotipo B come riportato sul sito del Los Alamos National Laboratory . La regione della trascrittasi oltre l’aminoacido 400 non viene analizzata. Il sistema riconosce la regione in esame ma attualmente non dispone di un vero algoritmo di allineamento. Pertanto, una volta individuati gli estremi della sequenza in esame, eventuali inserzioni e/o delezioni (reali o derivate da errori di sequenziamento) generano uno slittamento di lettura (frameshift) che causa un’interpretazione erroneaLe inserzioni di uno o due aminoacidi al codone 69 e le delezioni di un aminoacido al codone 67 o al codone 69 della trascrittasi sono comunque riconosciuti poiché specificamente ricercati dal sistema. Queste situazioni costituiscono quasi il totale delle reali inserzioni/delezioni nella trascrittasi inversa di HIV-1. In tutti gli altri casi di inserzione/delezione lo slittamento genera una serie di mutazioni consecutive che AntiRetroScan segnala come indice di sospetta anomalia. Segni diversi da lettere (es. * / -) eventualmente presenti nella sequenza sono rimossi e, se utilizzati per indicare basi non lette, generano pertanto anch’essi un frameshift. Altre segnalazioni indicative di possibili problemi nella qualità della sequenza riguardano:
-	la presenza di codoni di stop (TAA, TGA, TAG)
-	la presenza di codici degenerati a tre basi (B, D, H, V), comunque gestiti dal sistema
-	la presenza di codice degenerato a quattro basi (N), convertito dal sistema nella base wild type
La valutazione del sottotipo è effettuata in base alla semplice percentuale di omologia fra la sequenza in esame e una serie di sequenze di riferimento , in continuo aggiornamento, derivate dal sito del Los Alamos National Laboratory. Nonostante questo approccio fornisca in genere una buona indicazione nel caso di sottotipi puri, la valutazione di forme ricombinanti richiede l’effettuazione di un’analisi filogenetica completa, possibilmente includendo anche altre regioni del genoma virale.
Le conoscenze sulla farmacoresistenza agli antiretrovirali sono in continua evoluzione, soprattutto per i farmaci di più recente introduzione. I necessari periodici aggiornamenti del sistema comportano pertanto che le interpretazioni di uno stesso genotipo fornite in epoche storiche diverse possano differire.
Contatto
Per osservazioni o richieste di chiarimento inviate una mail a Maurizio Zazzi